Drugi etap oczyszczania usuwa rozpuszczalne substancje organiczne, składniki odżywcze, takie jak azot i fosfor, a także większość zawiesin, którym udaje się uniknąć oczyszczania w pierwszym stopniu. Najczęściej stosuje się procesy biologiczne, w których mikroorganizmy metabolizują związki organiczne i składniki odżywcze w celu wzrostu i reprodukcji. Dwa najczęstsze biologiczne procesy drugiego stopnia oczyszczania to systemy wzrostu dołączonego i zawieszonego. Proces wzrostu zawieszonego sprzyja rozwojowi zawieszonych kłaczków mikroorganizmów z pojedynczych organizmów obecnych już w ściekach i w powrotnym osadzie czynnym. Kłaczki zawierają organizmy, które mogą usuwać zanieczyszczenia poprzez środowisko tlenowe, anoksyczne i beztlenowe. Po usunięciu zanieczyszczeń kłaczki są wysyłane do drugiego stopnia oczyszczania, gdzie oddzielają się grawitacyjnie od wody. Część osadu na dnie osadnika drugiego stopnia jest następnie kierowana z powrotem, gdzie miesza się ze ściekami pierwszego stopnia (powrotnym osadem czynnym) w celu utworzenia mieszaniny ścieków z osadem. Pozostała część osadu usuwana jest z procesu (osad czynny ściekowy) w celu stworzenia idealnej ekologii mikroorganizmów. Systemy wzrostu dołączonego opierają się na mikroorganizmach, które dołączają się do podłoża i tworzą warstwę biologiczną. Osiadłe ścieki są mieszane lub natryskiwane na podłoże pokryte warstwą biologiczną, gdzie mikroorganizmy usuwają zanieczyszczenia. Fragmenty warstwy biologicznej i zawieszone kłaczki, podobnie jak w przypadku procesu wzrostu zawieszonego, są wysyłane do osadnika drugiego stopnia w celu separacji, gdzie osady są poddawane recyklingowi i usuwane, a czysta woda odprowadzana jest do następnego procesu.
Aby biologiczne oczyszczalnie mogły sprawnie funkcjonować, organizmy potrzebują składników odżywczych w zrównoważonych proporcjach, w tym węgla, azotu i fosforu (określanych jako C:N:P), jak również pierwiastków śladowych, w tym żelaza, miedzi, cynku, niklu, manganu, potasu, siarki i innych składników, które są zwykle obecne w ściekach. Powszechnie akceptowany stosunek C:N:P wynosi 100:5:1. W niektórych obiektach praca sprawnie przebiega przy odmiennym stosunku, podczas gdy w innych tworzy się szlam polisacharydowy lub obserwuje się wzrost bakterii nitkowatych, które hamują biologię i osiadanie w osadniku drugiego stopnia.
W celu ukończenia drugiego etapu oczyszczania można wykorzystać wiele procesów biologicznych, w tym zbiorniki napowietrzania z przepływem tłokowym, kompletne zbiorniki napowietrzania z mieszalnikiem, sekwencyjne reaktory biologiczne, rowy cyrkulacyjne, złoża biologiczne zraszane, reaktory biologiczne o ruchomym złożu, zintegrowane osady czynne ze stałą powłoką i inne.
Biologiczne usuwanie składników odżywczych (BNR) zmienia środowisko mikroorganizmów w celu usunięcia azotu i fosforu z wody. Proces BNR składa się z etapów beztlenowych (brak tlenu i azotanów), anoksycznych (brak tlenu, obecność azotanów) oraz tlenowych (obecność tlenu), podczas których woda przemieszczana jest przez szereg komór w celu wykonywania różnych funkcji biologicznych.
Można również stosować procesy oczyszczania chemicznego, takie jak chemiczne usuwanie fosforu. Fosfor, poprzez wprowadzenie chemicznego środka strącającego do zbiornika napowietrzania i osadników, jest usuwany w wyniku flokulacji, wiążąc się w związki nierozpuszczalne, które osadzają się i mogą zostać usunięte w postaci szlamu.